分子生物学

はじめに

DNAとRNAの違い

ヌクレオチド

相補的な核酸塩基

核酸を構成する糖

ヌクレオチドの伸長

DNA複製

DNAからタンパク質へ

タンパク質合成時のリボソームとtRNAの働き

セントラルドグマ

遺伝子工学の超基礎

PCR

細胞融合

 

はじめに

 高校時代、唯一真面目にやった科目ですので、基盤は、一番マシなはずです。能力以上を目指して頑張っていきたいと思います。

 

DNAとRNAとの違い

 

DNA

RNA

二重らせん

一重らせん

5単糖の2’末端にH基

5単糖2’末端にOH基

塩基にチミンを利用

塩基にウラシルを利用

寿命が長い

寿命が短い

プライマーがないと複製できない

プライマーがなくても複製できる

真核生物の場合、イントロンがある

真核生物でも、エキソン部分しかない(スプライシングのため)

触媒作用が見つかっていない

触媒作用がある(リボザイム)

 

核酸の基本構造=ヌクレオチド

・ヌクレオチドが、つながっていくことで、一本鎖のDNAorRNA(核酸)が出来ます。

・ヌクレオチドは、核酸塩基+糖+リン酸(一個から三個)から構成されます。

・ヌクレオシドにリン酸が結合した形が、ヌクレオチドです。

・糖と塩基は、グリコシド結合、糖とリン酸は、高エネルギーリン酸結合で形成されます。

・リン酸とリン酸の間にも高エネルギーリン酸結合して、エネルギーを蓄えています。よって、AMPADP,AMPの順に、多くのエネルギーを蓄えています。

ATPは、エネルギー通貨と呼ばれ、能動的な反応(自然には起らない反応⇔受動的)を助けます。

・ヌクレオチドの糖の違いにより、RNADNAを構成することが出来ます。RNAに利用される糖は、リボースで、DNAに利用される糖は、デオキシリボースです。

NTPNは、核酸塩基(GCAU)のどれでも良いことを、意味します。

dNTPdは、2’末端にOH基が無いことを示し、Nは、核酸塩基(GCAT)のどれでも良いことを、意味します。

 

相補的な核酸塩基

 相補的とは、シトシンならグアニン、アデニンならチミンorウラシルと水素結合することを言います。

核酸を構成する糖

・糖と言うと、普通、砂糖(ショ糖orスクロース)が思いつきます。

 

・ショ糖は、二糖で、グルコースと果糖(フルクトース)が結合して構成されています。

・ちなみにショ糖に結合している果糖は、五炭糖(フラノース型)で閉環しています。単独で、示した果糖は、六炭糖(ピラノース型)で閉環しています。

 

・糖は、核酸の構成でも非常に重要です。

・核酸を構成する糖は、五炭糖で二種類あります。

・一つは、RNAの基本構造に利用されるリボースです。

・もう一つは、DNAの基本構造に利用される糖は、2‘末端のOH基が無いため、デオキシリボースと言います。

・ちなみに、2‘末端と3’末端の両方にOH基が無い糖を、ジデオキシリボースと言います。これは、人工的に作られた糖で、サンガー法(塩基配列を決定する方法の一つ)に利用されます。

 

ヌクレオチドの伸長

 ヌクレオチドの伸長によって、RNAやDNAを合成します。

RNAの合成

ヌクレオチドは、糖の3'末端のOH基とα位のリン酸が、結合(ホスホジエステル結合)して、伸長します。5’末端から3’末端に方向性をもって伸長します。この方向性に従ってDNAポリメラーゼが働きます。

 

 

DNAの合成

ヌクレオチドは、糖の3'末端のOH基とα位のリン酸が、結合(ホスホジエステル結合)して、伸長します。5’末端から3’末端に方向性をもって伸長します。この方向性に従ってDNAポリメラーゼが働きます。RNAは、一本鎖ですが、DNAは、水素結合で二本鎖で存在します。二本鎖は逆方向に伸長していきます。※上の図は、塩基が変ですが、気にしないでください。(申し訳)

 

 

DNA複製

DNAからタンパク質へ

 

@DNAの情報は、mRNAに転写されます。

 

Aリボソーム内のP部位に、mRNAのコドンが、3’末端にアミノ酸が結合したtRNAのアンチコドン部位と結合します。(翻訳)

 

BP部位に結合しているtRNAのアミノ酸が解離して、隣のA部位に結合しているtRNAのアミノ酸にペプチド結合します。

 

Cこの作業が、連続し、ある所で、mRNAの終止コドンとtRNAは結合できず、反応が終わり、タンパク質が生成されます。

 

タンパク質合成時のリボソームとtRNAの働き

 

 

 

 

 

 

 

 

セントラルドグマ

クリックがもっと簡素な物を提案しました。また、生物がDNAから始まったと提案しました。この後、逆転写酵素、チミンはウラシルのメチル化、リボザイムなど様々な要因によってRNAから始まった説(RNAワールド)が強調されています。

遺伝子工学の超基礎

 

@目的とするDNAを制限酵素で切断します。

 

A目的とするDNAを組み込むDNAを同じ制限酵素で切断します。

 

B同じ制限酵素を使っているため、目的とするDNAを組み込むDNAに、目的とするDNAを組み込むことができ、この二つの切断部位は、水素結合によって結合します。(アニーリング)

 

C水素結合していますが、リン酸結合をしていないため、DNAリガーゼで結合します。組み換えDNAが生成できます。

 

D抗生物質に耐性をもつDNAを、同様な作業で、DNAに組み込みます。

 

Eこの組み換えDNAを宿主細胞に入れて、増殖させます。

 

F宿主細胞を抗生物質で処理し、増殖した組み換えDNAを精製します。

 

1 制限酵素

 制限酵素は、もともと大腸菌などの細菌が、ウイルスに感染した時にウイルスの塩基配列を切断する働きをもつ酵素です。(大腸菌自身は、修復酵素が存在するため制限酵素の影響を受けづらいです。)

 塩基配列をある特異的に切断する特性を生かし、遺伝子工学のはさみとして利用します。主に、付着末端(5’or3’)と平滑末端を切断します。

2 ベクター

 ベクターは運び屋と呼ばれ、目的遺伝子を宿主細胞に導入します。

 ベクターは自己複製できるDNA分子です。

 その例として、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドがあります。

 プラスミドベクター・・・5つの必須条件

 1複製開始点(Ori)を持つ。2環状DNA。3制限酵素サイトを多く持つ。(サイトの中には、多種の制限酵素が切断できる塩基配列を持っています。)4組換え体選択マーカーを持つ。5強力なプロモーターを持つ。

3 組換えDNAをもつベクターの選択

理想的な組み換え体

実際は上図のようにいかない。

実際は、上図のようになる。そのため、組換えに成功したベクターを選別しなければなりません。そこで、代表的なものを示します。

 

(1)抗生物質の利用(大腸菌など)

  プラスミド(ベクター)は、アンピシリン耐性(Apr)とテトラサイクリン耐性(Tcr)の両方を持たす。rは、耐性を示します。

  プラスミドに目的遺伝子が組込まれると、テトラサイクリン耐性が切断され、テトラサイクリン耐性が働かなくなる。

 

(2)栄養要求性の利用

  栄養要求性とは、ある栄養がないと死んでしまう特性です。

  抗生物質は、もともと細菌の効果があり、ヒトに効果のない選択的毒性を利用しているため、真核生物には効きません。よって、真核生物の組換え体選別には、栄養要求性を利用します。

  後は、抗生物質と同様、培地によって選別します。

 

(3)Blue-while selection

  lacZは糖分解酵素(βガラクトシダーゼ)の塩基配列を持っているため、βガラクトシダーゼが活性な時に青色を示し、不活性になると白色になる。これを、組換え体の選別に利用します。

  目的遺伝子をlacZに組み込むように仕組みます。もし、組換えが成功すると培地上で白色となり、組換えに失敗すると青色のままです。これより、白色を選んで終了です。

 

(4)平滑末端の利用

  まず、ベクターDNA、目的遺伝子を共に平滑末端で切断できる制限酵素で切断します。次に、ベクターDNAにはG(グリシン)ばかり、目的遺伝子はC(シトシン)ばかりの塩基配列を結合させます。そのため、ベクターDNA、目的遺伝子は、それぞれ自分自身では再結合できなくなり、目的遺伝子の組換えに成功したベクターDNAのみが生成できます。

 

(5)アルカリ性ホスファターゼの利用

  切断後、ベクターDNAと目的遺伝子の両方に5´末端にリン酸が生じます。ベクターDNAをアルカリ性ホスファターゼにより、両端のリン酸基をOH基に変換します。これにより、平滑末端の利用同様、自分自身で再結合できなくなり、目的遺伝子の組換えの成功率が上がります。

  これは、ベクターDNAのOH基と目的遺伝子のOH基が結合するため、組み込んだ宿主(大腸菌)のDNA修復酵素が、ベクターDNAのOH基をリン酸基に変換し、宿主のDNA合成酵素により、ベクターDNAと目的遺伝子を完全に結合します。

PCR

 

原理

 

@二本鎖DNAを一本鎖DNAに熱変性(95℃)させます。

 

A相補鎖(一本鎖)DNAに、プライマーをアニーリングさせます。(55℃)

 

B耐熱DNAホリメラーゼを使ってdNTPを相補鎖に合成します。(72℃)

 

C合成してできた二本鎖DNAを再び熱変性させます。このサイクルを30サイクル繰り返します。

 

増加率

 

@鋳型DNAが少ないので、プライマーが付着しない時があります。

 

A2のn乗増幅します。

 

Bサイクル数が増すと、DNA合成酵素が失活したり、dNTPが壊れたり、鋳型DNAが壊れたりします。

 

 

 

 

⇒細胞内のmRNA量を測定できます。(Real time PCR)

 

mRNA[@]は、mRNA[A]の三倍の生産量があることを判断するために、逆転写酵素を使ってcDNA[@]とcDNA[A]を作ります。それぞれをPCRで増幅すると、cDNA[@]は、cDNA[A]より傾き(増幅率)が大きくなります。

 

 

 

 

欠点

 

@プライマーを合成するために、あらかじめDNA配列が分かっている必要があります。

⇒進化上での共通の配列から推測します。

DNAクローニングは、プライマーがいりません。

 

A増幅できる長さが、3000から5000塩基に限られます。

DNAクローニングは、20万塩基まで増幅できます。

 

B修復する酵素がないので、DNA合成時のエラー率が高くなります。

DNAクローニングは、修復酵素があるため、エラー率が低いです。

 

利点

 

@点突然変異の導入が簡単です。

 

わざとプライマーに点突然変異を起こすことができます。

 

A未知の領域を増やすことができます。(inverse PCR)

 

細胞融合

細胞融合を植物に行う時は、酵素(セルラーゼ((細胞壁を破壊))、ペプチナーゼ((細胞と細胞を離す)))処理によって、プロトプラストにします。大腸菌の場合は、濃い塩(CaCl)処理により、細胞壁を破壊し、コンピテント細胞にします。

 

 細胞Aと細胞Bは、PEG(ポリエチレングリコール)とCaイオンや、電気刺激、センダイウイルスによって、細胞融合すると、シンカリオン(体細胞雑種・二種のDNAが共存)、ヘテロカリオン(核が二つ存在)、サイブリッド(細胞質雑種)の三種類の形成を示します。※大きな丸が核で、小さな丸が細胞質のある器官です。